原位杂交是指将带有标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，最后通过显色或荧光检测对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。

其中原位杂交（荧光）可进行单标、双标和三标检测，即实验时分别采用一种、两种和三种不同荧光素标记的探针同时检测一个样本。

1、原位杂交（DAB显色）：

（1）石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

（2）消化：根据组织固定时间长短，切片于修复液中煮沸10-15分钟，自然冷却。后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30 min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。

（3）阻断内源性过氧化物酶：滴加3%甲醇-H2O2，室温避光孵育15min，将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

（4）预杂交：滴加预杂交液，37°C孵育1h。

（5）杂交：倾去预杂交液，滴加含探针杂交液, 恒温箱 37度杂交过夜。

（6）杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。

（7）封闭：滴加封闭血清 BSA。室温30min。

（8）滴加鼠抗地高辛标记过氧化物酶(anti-DIG-HRP)：倾去封闭液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育40min，后PBS洗4次×5min。

（9）DAB显色：切片稍甩干后，在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，纯水冲洗切片终止显色。

（10）复染细胞核：Harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1%盐酸酒精分化数秒，自来水洗，氨水返蓝，流水冲洗。

（11）脱水封片：将切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I 6min—100%酒精II 6min-正丁醇6min—二甲苯透明，将切片从二甲苯中拿出稍晾干后，中性树胶封片。

2、原位杂交（荧光）：

（1）脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

（2）消化：根据组织固定时间长短，切片于修复液中煮沸10-15分钟，自然冷却。后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。

（3）预杂交：滴加预杂交液，37°C孵育1h。

（4）杂交：倾去预杂交液，滴加含探针杂交液, 恒温箱37度杂交过夜。

（5）杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。

（6）DAPI复染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，冲洗后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。

1、石蜡切片常温运输；冰冻切片-20°运输。

2、细胞爬片加原位杂交固定液固定15min后，密封，4°运输。

1、全面且深入的系统化病理研究服务

沃登病理实验中心具有10余年的服务经验，已形成从病理实验、病理成像到病理分析的完整研究体系。一流的硬件平台，经验丰富的技术团队，稳健踏实的做事风格，让我们成为众多科研人员病理实验合作伙伴的首选品牌。

2、以标准化实验作为服务宗旨

沃登以一流的设备和技术人员作为可靠基础，不断的进行方法的开发优化，确保实验过程的可重复性，实验结果的可靠性与一致性。

3、量身定做的技术支持

沃登秉承着“用可靠成就科研”的理念，在科研实验领域已深耕多年，服务了众多院校机构，拥有丰富的经验和完善的管理体系。凭借一流的技术人才，为客户的科研需求提供专业的建议，量身打造科研实验方案。